大鼠心肌成纖維細(xì)胞衰老檢測方法與步驟：

（1）細(xì)胞接種前在6孔培養(yǎng)板中預(yù)先放置滅 菌的細(xì)胞片，每孔加入1×10E5個細(xì)胞，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞在細(xì)胞片上生長。

（2）在超凈工作臺中吸棄6孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，加入×1 PBS，洗滌細(xì)胞1次，隨后加入2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，室溫條件下固定3~5分鐘。

（3）吸棄2%甲醛/0.2%戊二醛固定液，加入×1 PBS，洗滌細(xì)胞3次，每次3分鐘。

（4）吸棄×1 PBS，加X-Gal溶液以浸沒細(xì)胞片為宜，37℃孵育4~8小時或過夜，用保鮮膜包被6孔培養(yǎng)板以防染液蒸發(fā)。

（5）取出細(xì)胞爬片，去離子水沖洗2次，再次用固定液固定4分鐘，流水輕輕沖洗。

（6）將細(xì)胞爬片按此順序脫水、透明∶95%酒精I(xiàn)（2分鐘）→95%酒精Ⅱ（2分鐘）→100%酒精I(xiàn)（2分鐘）→100%酒精I(xiàn)（5分鐘）→二甲苯I（2分鐘）→二甲苯Ⅱ（2分鐘）。

（7）中性樹膠封片。

（8）在普通光學(xué)顯微鏡下觀察衰老細(xì)胞形態(tài)。

每張片子鏡下計數(shù)400個細(xì)胞，確定X-Gal染色陽性細(xì)胞（衰老細(xì)胞）在細(xì)胞群體中的所占的百分比即衰老細(xì)胞率（藍(lán)染細(xì)胞數(shù)/總計細(xì)胞數(shù)×100%）。

細(xì)胞衰老檢測注意事項：

①X-Gal溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配。

②細(xì)胞固定時間過長或固定之后清洗不干凈，均會影響后續(xù)的酶反應(yīng)。